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DSP 空间转录组/蛋白质测序

DSP空间转录组/蛋白质测序——空间自定义区域转录组/蛋白质表达检测

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    GeoMx Digital Spatial Profiler(DSP)是NanoString Technologies推出的新一代空间多靶标分析系统,结合了组织影像分析和测序定量技术,实现人和小鼠组织切片上18,000多种编码基因和140多种蛋白的定量分析。

技术路线

  • 组织样本贴片后,利用DSP Oligo 标记探针/抗体和免疫荧光标记抗体对样本孵育;再通过显微扫描获取的荧光标记图像,用于圈选感兴趣的区域(Region of Interest ROI);用UV光解每个ROI的DSP barcode(该barcode与基因是唯一对应关系),或对ROI内不同荧光标记区域分割后,再光解 DSP barcode,实现基因表达水平定量。

    切片

    质控

    染色成像

    探针杂交

    建库测序

    数据分析

定量试剂

  • 靶点特异性互补序列/抗体通过光可切割连接子与DSP barcode连接。利用UV照射ROI释放并收取探针/抗体上的DSP barcode。由于DSP barcode与基因是唯一对应关系,对收集的barcode序列建库测序,即可获取对应基因及其表达信息。

DSP 转录组探针

  • 靶点特异性互补序列/抗体通过光可切割连接子与DSP barcode连接。利用UV照射ROI释放并收取探针/抗体上的DSP barcode。由于DSP barcode与基因是唯一对应关系,对收集的barcode序列建库测序,即可获取对应基因及其表达信息。
    物种 探针类型 探针信息
    人和小鼠 WTA(全转录组) 检测>18000个基因
    CTA(癌症相关基因转录组) 检测>1800个癌症相关基因
    物种 基因/通路
    Core CD45、Ki-67、Beta-2-microglobulin、CD31和6个 controls
    小鼠 CD45、Ki-67、CD31、GFP和6个 controls
    Module (14个) Immune Cell Typing、IO Drug Target、Immune Activation Status、Pan-Tumor、Cell Death、
    PI3K/AKT Signaling、MAPK Signaling、Myeloid、Neural Cell Typing、Alzheimer’s Disease
    Pathology、Alzheimer’s Disease Pathology Extended、Parkinson’s Disease Pathology、Glial Cell
    Subtyping、Autophagy
    人和小鼠

免疫荧光标记

  • DSP仪器支持4种荧光标记抗体染色成像(含核DNA荧光染料syto13)。J9九游会可提供PanCK、CD45、Iba1和Beta amyloid、 Syto13 (DNA) 等荧光标记抗体,同时支持客户自行购买适用于免疫荧光标记的直标抗体。
    Channel Excitation (peak/bandwidth) Emission (peak/bandwidth) Emission (peak/bandwidth) Suggested Fluorochromes Alzheimer
    FITC/525 nm 480 /28 nm 516/ 23 nm Syto13 (DNA)AF488 DNA
    Cy3/568 nm 538/ 19 nm 564/ 15 nm AF532、PE Syto83 (DNA) PanCK Iba1
    Texas Red/615 nm 588/ 19 nm 623/ 30 nm AF594 CD45 Texas Red/615 nm
    Cy5/666 nm 645/ 19 nm 583/ 30 nm AF647 Dylight 650

圈选方式

  • DSP平台根据研究目的选择任何感兴趣的组织区域(region of interesting, ROI)检测RNA或蛋白质表达水平。DSP平台提供多种ROI的选择方式:几何圈选、分割圈选、散在细胞类型圈选、等高线圈选、网格圈选。

信息分析

  • 数据经过严格质控,采用NanoString官方推出的分析流程,完成ROI 差异表达分析和功能富集分析等内容,确保数据分 析准确性和可靠性。
    分析内容
    数据截取与比对 样本一致性
    样本质控 差异表达基因分析
    探针质控 GO富集分析
    数据归一化 KEGG 富集分析
    聚类/降维 Reactome 富集分析

送样建议

  • 样本类型 送样量/样 保存条件 运输条件
    OCT包埋冰冻组织块 1块 密封后,-80℃保存包埋盒外标注切割面 冰袋运输
    FFPE 组织块 1块 密封后,4℃保存 冰袋运输
    冰冻切片 ≥ 4张切片(邻片) 切片厚度~5 μm 使用防脱片载玻片贴片;密封后,-80℃保存 冰袋运输
    FFPE 切片 ≥ 4张切片(邻片)切片厚度4~6 μm 使用防脱片载玻片贴片;玻片干燥密封,4℃保存时间<14天 冰袋运输

应用方向


常见问题

  • 1. 免疫荧光抗体怎么选?

    • 免疫荧光标记是DSP空间组学研究的初始步骤之一,也是重要的环节。DSP仪器具有4个荧光通道,可以对应检测4种荧光标记;通常FITC通道用作核染,其余三个检测特异性抗体荧光标记。关于免疫荧光标记抗体选择,有以下几种方案:
      (1)采用J9九游会提供的直标抗体,包含PanCK、CD45、Iba1、Beta amyloid 和 Syto13 (DNA)。
      (2)如果所需抗体不在J9九游会提供范围内,支持自行购买适用于免疫荧光标记的直标抗体(即一抗偶联荧光基团的免疫荧光标记抗体),抗体荧光符合DSP仪器荧光通道。
      (3)如果没有供应商提供所需直标抗体商品,支持自行购买适用于免疫荧光的一抗和荧光染料,寄送至J9九游会将一抗与荧光染料偶联进行免疫荧光标记,染料荧光信号需符合DSP仪器荧光通道。
      按以上顺序依次为优先推荐选项
  • 2. DSP 空间转录组/蛋白质测序如何准备样本?

    • DSP 空间转录组支持OCT包埋冰冻组织、FFPE石蜡块、冰冻切片和FFPE切片等样本送样。冰冻组织(干冰运输)和FFPE石蜡块(冰袋运输)包埋好后,寄送至J9九游会。冰冻切片和FFPE切片需要贴在防脱片载玻片上,密封保存寄送至J9九游会,冰冻切片采用干冰运输,FFPE切片采用冰袋运输。组织切片贴在下图绿色区域内、没有皱着和破损,否则将无法获取DSP空间数据。

      图注:浅蓝色边框为载玻片大小;深蓝色六边形为仪器固定区域;绿色矩形为贴片区域和仪器捕获范围
  • 3. DSP 空间转录组与10x Visium 空间转录组有什么区别?

    • DSP空间转录组可以自定义圈选组织位置检测转录组或蛋白质测序,检测的组织面积是14.6mm*36.2mm,支持的送样类型更多;10x Visium 空间转录组对整张组织切片无偏检测转录组表达水平,可检测组织面积6.5mm*6.5mm。具体参数如下表所示:

      10x Genomics Visium NanoString GeoMx DSP
      组织兼容性 包埋冷冻样本 FFPE石蜡样本 包埋冷冻样本、FFPE样本、冰冻切片、FFPE切片
      RNA质检 RIN值>=7 DV200>=50% 无明确要求
      组织贴片 10x Visium专用玻片 防脱片玻片
      组织大小 6.5mm*6.5mm 14.6mm*36.2mm
      检测区域 捕获框内mRNA无偏检测 自定义的感兴趣区域(ROIs)
      细胞分辨率 1-10个细胞/spot >100个细胞/ROI
      捕获的RNA方式 poly(A)捕获 特异性探针杂交 特异性探针杂交
      测序深度要求 5w read pairs/spot 2.5w read pairs/spot 100 read pairs/μm2
      物种限制 无限制 人和小鼠 人和小鼠

      表2 DSP与10x Visium 空间转录组测序参数比较

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