三、研究结果

• 1. 人巨细胞病毒（HCMV）感染细胞后上调在过氧化物酶体生物合成和脂类代谢过程中起作用的蛋白

  文章在人成纤维细胞中鉴定到60个与过氧化物酶体相关的蛋白，并选取感染早期（immediate early，IE，对应感染时间点6hpi）、中期（delayed early，DE，24 hpi）和末期（late，L，48~120 hpi）的细胞进行靶向蛋白质组定量研究，发现其中的52种蛋白在感染过程中显著上调（图 1B），蛋白表达上调发生在病毒感染的中期。为了更好地区分在病毒感染的中期还是后期基因对过氧化物酶体蛋白的表达上调调控，作者对病毒进行了 UV 照射后，用该病毒感染细胞并加入了一种病毒 DNA 复制抑制剂，磷酰基甲酸酯（PFA）。被感染的细胞在病毒感染末期基因表达产物显著减少，PRM 蛋白质组学实验表明过氧化物酶体蛋白表达上调不依赖于病毒感染末期的基因调控，而受控于病毒感染早期或中期的基因调控。聚类分析发现，与过氧化物酶体早期合成有关的蛋白在48 hpi 时就已经上调了两倍，而与脂质代谢有关的蛋白在72 hpi 时达到两倍上调丰度。差异最显著的蛋白质是与过氧化物酶体形成相关的蛋白，如与细胞膜形成有关的蛋白 PEX3 和 PEX16，以及基质传输（matrix import）相关的蛋白 PEX13 和 PEX14。醚脂和纤溶酶合成发生在感染后期，醚脂合成是过氧化物酶体特有的，而病毒粒子中常聚集大量的纤溶酶（图1C，图1D）。基于这些数据，文章假设 HCMV 感染过程中，促进了过氧化物酶体形成，随后由于宿主的防御或者病毒复制等原因，导致过氧化物酶体脂质代谢发生改变。

• 2. 感染后期过氧化物酶体数量增加是包膜病毒 HCMV 和 HSV-1 的共同特征

  病毒感染后，细胞中的过氧化物酶体在96 hpi 时上调了3.6倍（图2B，图2C），病毒感染后加入 PFA 得到了同样的结果，但是经 UV 照射后的病毒感染后，过氧化物酶体的数量没有增加（图2D）。鉴于过氧化物酶体在脂质代谢中的关键作用，对过氧化物酶体形成过程的调控可能是几种病毒的共同特征。尤其是依赖脂质形成病毒包膜的病毒。文章使用了包膜病毒 HSV-1 和非包膜病毒ADV5 进行实验，感染人成纤维细胞（HFs），结果显示与 HCMV 类似，HSV-1 感染后期（16 hpi）也出现了过氧化物酶体升高（图2E，图2F），而 ADV5 仅在感染的前期（4 hpi，12 hpi）出现过氧化物酶体升高，感染后期（20 hpi）没有明显升高（图2G，图2H）。以上结果揭示了过氧化物酶体在包膜病毒感染过程中起着重要的作用。

• 3. 过氧化物酶体对 HCMV 和 HSV-1 病毒的复制是必需的

  使用4-丁酸苯酯在人成纤维细胞中诱导生成过氧化物酶体之后，再用 HCMV 和 HSV-1 以及 ADV5 感染，结果显示与对照相比，过氧化物酶体诱导生成的细胞在被 HCMV 和 HSV-1 感染后含有更多的复制病毒，而被 ADV5 感染后病毒复制没有明显增加（图3A，图3B）。为了研究过氧化物酶体形成过程中的哪个环节影响病毒的复制，作者使用 CRISPR/Cas9 技术（图3E）构建了多个基因敲除（细胞膜聚集相关基因 PEX3、PEX19，基质传输相关的基因 PEX7，分裂相关的基因 PEX11B）细胞系（图3C）。结果显示PEX3 和 PEX19 基因敲除的细胞因阻碍了细胞膜的生成，所以没有产生过氧化物酶体（图3D），且存在病毒复制缺陷（图3F）；PEX11B 基因敲除的细胞因阻止了分裂，导致出现变大的和被拉长的过氧化物蛋白酶体（图3D）；PEX7 基因敲除的细胞，也影响了病毒的产出，说明基质传输（matrix import）对病毒复制也起着重要的作用。相比较来说 PEX11B 基因敲除的细胞中，HCMV 病毒的复制反而有一定的增加（图3F）。临床细胞样本的实验结果显示，PEX1 突变细胞 GM16513，PEX26 突变细胞 GM07371 中，HCMV 病毒的复制比对照低2~3倍，PEX26 另一株突变细胞 GM16866 中病毒基本失去了复制的能力（图3G）。以上结果显示过氧化物酶体是 HCMV 病毒复制和输出的必要因素。

• 4. 过氧化物酶体的增殖通过已存在的过氧化物酶体的生长和分裂而实现

  文章接下来分析了过氧化物酶体在病毒感染过程中是如何增殖的。过氧化物酶体的数量与三个过程有关：从头生成（k_d）、原有的过氧化物酶体分裂（k_f）、被吞噬（图4A）。作者建立了生物化学随机模型和推理过程，在不干扰过氧化物酶体生物发生系统的情况下，估计过氧化物酶体生物生成率（图4B）。图4C 显示了原始成纤维细胞过氧化物酶体随时间的数量变化。K_f 似乎是过氧化物酶体的主要来源途径，是 k_d 途径来源的10~20倍（图4D）。以上结果表明未感染的 HFs 过氧化物酶体丰度主要来自已存在过氧化物酶体的生长和裂变，而这也是 HCMV 病毒感染过程中过氧化物酶体增殖的途径。MFF 和 FIS1 是过氧化物酶分裂过程中的两个相关蛋白，在未感染病毒的 HF 细胞中，MFF 和 FIS1 定位在线粒体上，病毒感染120 hpi 时间点上，观察到定位在过氧化物酶体上的MFF 和 FIS1 急剧增多（图4 E-G） 。

• 5. HCMV 感染改变过氧化物酶体形态，提高过氧化物酶体膜-腔比值

  未被感染的 HF 细胞中，过氧化物酶体呈现圆形，尺寸和形状均一（图5A）。然而感染后120 hpi 时间点时，观察到高度增大的和稍微缩小的过氧化物酶体。图5B 显示了过氧化物酶体在病毒感染后，表面积和体积均发生变化。感染120 hpi 时间点时，过氧化物酶体在长度、表面积和体积上都明显增大（图5C）。因此，在病毒感染细胞后，过氧化物酶体不仅数量增加，平均尺寸也变大。表面积与体积的比值（SA：V）往往与尺寸呈反比，对于不规则形状，该比值往往大于规则形状（图5E）。通过二次方程做图发现，在 HCMV 感染120 hpi 时，过氧化物酶体的SA：V比值最大（图5F）。PEX11B 基因敲除的细胞未被感染时，蛋白酶体也增大，呈拉长的形状，大小不均一，但是呈管状（图5G上行）；被感染后，呈不均一的扁平状，并且有的增大，有的缩小（图5G下行），这与野生型 HF 细胞的120 hpi 时的形状相似。PEX11B 敲除的细胞在120 hpi 时过氧化物酶体也出现了两极分化的形状（图5H）。这些结果表明：HCMV 导致了过氧化物酶体形态的改变，不依赖过氧化物酶体的分裂，从而提高膜腔比，进而增强促进与过氧化物酶体膜相关的功能，促进病毒复制。

• 6. 与 HCMV 类似，HSV-1 感染也改变过氧化物酶体的形态，而 ADV5 感染则不同征

  在 HSV-1 感染的后期（16 hpi），观察到了增大的和缩小的过氧化物酶体（图6A），形状也呈现两极分化（图6B），长度和表面积增加（图6C），在16 hpi 时SA：V比值升高（图6D）。而 ADV5 感染后在感染早期（4 hpi）和后期（20 hpi）都没有发现形态的明显变化（图6C，6E）。

• 7. 过氧化物酶体促进纤溶酶体合成帮助病毒复制

  过氧化物酶 GNPAT 和 AGPS，催化纤溶酶合成的前两个关键步骤，纤溶酶前体在 sn-1 位置含有醚键烷基（图7A）。溶酶体富集于 HCMV 病毒膜上，它们的调控和功能尚不明确。为了证明是否感染引起了纤溶酶体的合成，文章用 LC-MS 检测了 HCMV感染细胞在120 hpi 时的纤溶酶水平（图7B）。文章鉴定到15种乙醇胺纤溶酶涵盖3种常见的 sn-1 烷基，8种纤溶酶丰度提高了5倍以上。为了说明纤溶酶体增加是特异性针对过氧化物酶的反应，文章测试了 PEX3 和 PEX11B 敲除细胞中的纤溶酶体（图7C），结果显示 PEX3 细胞中的纤溶酶体明显降低，PEX11B 细胞中纤溶酶体降低不明显，因为过氧化物酶体的存在仍能促进其合成（图7D）。GNPAT 敲除不影响 DE 和 L 病毒基因（图7E），却能降低病毒在上清和细胞中的合成（图7F）。这些结果说明纤溶酶体合成不是病毒胞外分泌和病毒基因表达所需要的，却是病毒的二次组装和下一次感染所必需的（图7G）。