2022年6月29日，复旦大学附属肿瘤医院吉芃、龚悦、金明亮、吴怀亮、国琳玮、裴雨晨、 柴文君、江一舟、刘引、马晓燕、狄根红、胡欣、邵志敏等学者在Science Advances期刊发表了题为“In vivo multidimensional CRISPR screens identify Lgals2 as an immunotherapy target in triple-negative breast cancer”的研究论文。该研究通过CRISPR筛选和单细胞转录组分析，对具有多种免疫缺陷特征的不同小鼠模型进行疾病相关免疫基因筛选，表征了不同肿瘤微环境中的基因功能，恢复了Ido1等经典免疫治疗靶点，发现了三阴性乳腺癌（TNBC）免疫治疗新靶点——Lgals2。该研究结果对重新审视肿瘤细胞和免疫系统的相互作用具有直接意义，可作为开发新药和治疗策略有力支持。

该文章中的单细胞转录组测序服务由J9九游会提供。

研究背景

TNBC恶性程度较高，预后效果较差，并且具有较高的早期复发率但缺少疗效预测指标。多项3期临床试验表明，免疫检查点抑制剂联合辅助化疗可能对一些 TNBC患者产生临床影响。但是免疫检查点抑制剂对TNBC患者的有效率不高，这表明患者体内还可能存在额外的免疫逃逸机制。鉴于免疫系统的复杂性，在体内高通量 CRISPR筛选中，最好针对肿瘤应用几种不同的免疫选择压力，以确定临床相关靶点。

研究路线

第一轮CRISPR筛选识别候选肿瘤相关免疫基因

作者设计并生成了一个小鼠DrIM文库，生成并转导Cas9稳定表达的小鼠TNBC细胞系4T1。体外培养后，将DrIM转导的4T1-Cas9细胞皮下移植到免疫活性BALB/c小鼠和免疫缺陷非肥胖糖尿病 (NOD)–Prkdc scid II2rg null(NPG) 小鼠，以比较肿瘤细胞的不同免疫选择压力。发现了如：组织相容性2,D区基因座1（H2-D1），也称为主要组织相容性复合物I类分子（MHC-I )，可以将抗原呈递给CD8+ T细胞并参与免疫监视。Yap1是Hippo通路最重要的效应子之一，可以影响NK和T细胞以促进免疫抑制性 TME。

第二轮CRISPR筛选揭示不同免疫压力下选定基因的免疫反应特征

作者为第二轮体内筛选生成了一个mini-DrIM文库，设计了具有不同免疫选择压力的更复杂的条件，构成了六种免疫选择压力。结果表明Nt5e促进肿瘤从 NK 细胞介导的杀伤中逃逸，并恢复Ido1等经典免疫治疗靶点。

探索TNBC中介导免疫抑制的假定必需基因

使用之前发布的TNBC数据库，在TNBC队列和功能筛查读数的交叉分析的基础上，最后选择了Lgals2。发现Lgals2在体内影响肿瘤生长，并且其介导的免疫抑制可能依赖于TME。

单细胞RNA-seq揭示了TME中Lgals2 诱导的巨噬细胞极化

scRNA-seq数据表明肿瘤细胞内Lgals2 表达水平升高可诱导肿瘤相关巨噬细胞数量增加。并通过巨噬细胞集落刺激因子CSF1及其受体CSF1R促进巨噬细胞M2样极化和增殖，导致TNBC微环境免疫抑制性。

研究结论

该研究恢复了Ido1等经典免疫治疗靶点。此外，功能筛选和转录组分析确定 Lgals2是TNBC中涉及免疫逃逸的候选调节剂。机制研究表明，肿瘤细胞固有的 Lgals2通过CSF1/CSF1R 轴诱导肿瘤相关巨噬细胞数量的增加，以及巨噬细胞的M2样极化和增殖，这导致了TNBC微环境的免疫抑制性质。使用抑制性抗体阻断Lgals2 成功地阻止了肿瘤生长并逆转了免疫抑制。总的来说，该研究结果为Lgals2作为TNBC中潜在的免疫治疗靶点提供了理论基础。